機體在受到病原體攻擊后產生相應的免疫反應，如免疫細胞亞群、細胞因子水平的變化，可作為臨床診療參考指標；在免疫反應檢測過程中，流式細胞儀是必不可少的工具之一。今天就來介紹一款服務在疫情第一線的流式細胞儀。

1 Guava—傳染病研究中發揮的作用

Luminex公司旗下Guava? easyCyte? 微毛細管流式細胞儀具有靈敏度高、廢液少(ml級)等特點，在流行病特別是急性傳染病研究中具有明顯優勢。

埃博拉疫情期間，Guava多參數流式細胞儀就已經投入到了疫區第一線。科學家在《Nature》雜志上發文，利用Guava 8在位于幾內亞埃博拉疫區的流動實驗室中建立了對患者的持續跟蹤體系，利用PBMC樣本評估患者自發病到治愈/死亡期間不同階段的免疫反應，從而在死亡患者體內發現了一類特異性的T細胞亞群，并提出了利用已有藥物靶向這類T細胞進行治療的可能性[ref 1]。

劃重點啦！

Guava在傳染病研究中的優勢

1. 廢液少：每運行8小時僅產生 <50 ml的廢液量，適用于感染性材料的研究；

2. 體積小：結構緊湊，整體化程度高，便于運輸，安裝、維護簡便；

3. 性能穩定：確保產生的數據質量。

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2 Guava—病毒顆粒檢測

常規檢測病毒和/或病毒顆粒的透射電子顯微鏡、ELISA、病毒滴定等方法無法分析各類病毒比例或區分感染性與非感染性病毒顆粒。

流式細胞儀能夠直接檢測單個病毒顆粒及其特征。Landowski等人單獨使用抗體直接檢測病毒樣顆粒(NiVLPs)，開發出新的流式病毒學研究工具，可高通量測量病毒動力學，研究病毒顆粒表面糖蛋白比例[ref 2]。

作者利用Guava 8HT檢測發現，相較于下圖A中PBS緩沖液，圖B中VLPS病毒FSC/SSC信號可以很好的與背景分開。圖C-F顯示分別連接了1種、2種和3種不同病毒糖蛋白片段后VLPs在四象限門內的表達變化。

Guava的超高靈敏度確保在針對如病毒等微小顆粒的檢測中，不僅能夠對目標實現清晰分群，還可以對病毒入侵細胞的機理進行分析研究。

3 Guava—免疫分型研究 

免疫細胞計數和分型是評估病毒感染后機體免疫反應的重要參數，流式則是必不可少的檢測手段。

武漢協和醫院的研究團隊發表在預印本平臺MedRxiv上的一篇文章描述了不同疾病嚴重程度的新冠患者外周血淋巴細胞亞群比例變化[ref 3]。分析顯示：

1. 重癥患者入院時外周血淋巴細胞的絕對計數顯著低于輕癥患者，而白細胞和中性粒細胞的絕對計數明顯高于入院時的輕癥患者(下圖)。

2. 與輕癥患者相比，重癥患者CD3+ T細胞、CD4+和CD8+T細胞亞群計數持續下降，而B細胞和NK細胞計數無顯著性差異(下圖)。

3. 進一步評估中性粒細胞/CD8+T細胞比例(N8R)、中性粒細胞/淋巴細胞比例(NLR)、嗜中性粒細胞計數(NEC)、白細胞計數這4個變量。詳細統計分析結果顯示N8R可作為監測重癥患者的預后指標。

Tips:

Guava免疫分型多色實驗方案

1. 取10 μl 成人全血，與抗CD45，CD3，CD4，CD8，CD16，CD56，CD19，CD45 RA和CD62L抗體混合，室溫孵育20分鐘；

2. 加入180 μl 裂解液，室溫反應15 分鐘，上機檢測。

3. 圈門：

• CD45+的淋巴細胞進一步用SSC vs. CD3圈門；

• T細胞(CD3+/CD45+)再用CD4 vs. CD8圈門；

• CD4+和CD8+的T細胞分別用CD45RA和CD62L區別原始和記憶細胞。

• CD3-細胞進一步分為CD19+的B細胞和CD16+/CD56+的NK細胞。

如圖所示，T、B、NK各細胞亞群清晰可見，并可對各細胞亞群進行絕對計數，提供準確檢測結果。

Reference：

1. Paula Ruibal et al. Nature, 533 (2016): 100–104.

2. Matthew Landowski et al. Journal of Virology, 88 (2014): 14197–14206.

3. Jing Liu et al. Longitudinal characteristics of lymphocyte responses and cytokine profiles in the peripheral blood of SARS-CoV-2 infected patients. medRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.16.20023671

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